TAILIEUCHUNG - Antibody Phage Display Methods and Protocols - part 3

Tập trung các tiết mục VL tiêu hóa bằng cách chiết xuất phenol / chloroform, tiếp theo là lượng mưa ethanol. Gel làm sạch đoạn DNA lớn và ước tính nồng độ của nó bằng cách so sánh với các đánh dấu. 9. Thực hiện các phản ứng buộc thắt đủ để ligate xấp xỉ 0,4 mg mảnh DNA VH-mối liên kết giả vào một hồ bơi 1 mg Vκ và thư viện Vλ. 10. Electroporate vào E. coli TG1 tế bào | 68 Lennard 8. Concentrate the digested VL repertoire by phenol chloroform extraction followed by ethanol precipitation. Gel-purify the large DNA fragment and estimate its concentration by comparison with markers. 9. Perform sufficient ligation reactions to ligate approx pg dummy VH-linker DNA fragment into a 1-pg pool of the VK and V libraries. 10. Electroporate into E. coli TG1 cells and plate out as described previously see Subheading . . Aim to generate between 1 X 106 and 1 X 107 recombinants carrying VL inserts with upstream scFv linker and dummy VH. . Construction of the scFv Library see Notes 8 and 9 1. Amplify the VH and linker-VL DNA fragments separately from each of the cloned repertoires. Perform 50 pL PCR reactions using the cycling parameters described previously see Subheading . amplifying the VH repertoire with pUC19rev and JHFor primers and the VL repertoire with reverse JH and fdtetseq primers. Purify the products from 1 TAE agarose gels and estimate DNA concentrations by comparison with markers. 2. Combine equal amounts of the VH and linker-VL PCR products 5-20 ng each increase the total volume to 100 pL with ACS reagent-grade H2O prior to recovery of the DNA by ethanol precipitation. Resuspend the DNA pellet in 25 pL H2O. 3. To perform the assembly reaction add the following reagents to the pooled VH and linker-VL products and perform 25 cycles of 94 C for 1 min followed by 65 C for 4 min pL 10X Taq buffer pL 5 mM dNTP stock and pL Taq polymerase U . 4. Prepare 50 pL pull-through PCR reactions pairing each VH BackSfil primer with either the JK1-5ForNotI primer mix or the JÀ1-5ForNotI primer mix. Replicates of each reaction are advisable to maximize the diversity of the final library. Using pL assembly DNA reaction amplify with cycling parameters described previously see Subheading . . The correct size of the assembled construct is around 700 bp. 5. Pool and concentrate the PCR products by phenol chloroform .

• Y học thường thức
• giáo trình y học
• tài liệu y học
• phương pháp sinh học phân tử
• thuốc kháng sinh
• tế bào ung thư
• Giáo trình Kinh tế y tế
• Kinh tế y tế
• Y tế công cộng
• Y học dự phòng
• Quản lý tài chính y tế
• Tài chính y tế
• Lập kế hoạch tài chính y tế
• y học dân tộc
• y học phổ thông
• bệnh thường gặp
• y học thực hành
• kiến thức y học
• chuyên ngành y khoa
• tài liệu y khoa
• lý thuyết y học
• bài giảng y học
• bệnh lâm sàng
• chuẩn đoán bệnh
• chuyên ngành y học
• dịch tễ học y học
• giáo trình dịch tễ học y học
• bài giảng dịch tễ học y học
• đề cương dịch tễ học y học
• tài liệ dịch tễ học y học
• nghiên cứu y học
• y học cổ truyền
• Sách y học cổ truyền Việt Nam
• sách kinh điển
• Dược Học
• Huyệt đạo
• Bệnh học thực hành
• Dược vị
• giáo dục y học
• Giáo trình
• Giáo án
• ngành y học